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數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR)實驗介紹
原理:是一種近年來興起的核酸分子絕對定量分析技術(shù),數(shù)字PCR的面世解決了多年來qPCR一直沒有解決的問題,首先是數(shù)字PCR檢測靈敏度極高,可以檢測單個核酸分子,另外就是數(shù)字PCR并不依賴標準曲線的絕對定量。數(shù)字PCR系統(tǒng)可將PCR反應(yīng)體系均勻分割成數(shù)萬個反應(yīng)微滴,每個微滴平行、獨立完成PCR擴增,通過判定每個微滴擴增完成后熒光信號的有無進行統(tǒng)計,最后根據(jù)泊松分布公式計算得到原體系中靶標基因的初始濃度或拷貝數(shù)。數(shù)字PCR系統(tǒng)可應(yīng)用在:腫瘤液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、病原微生物檢測、病毒載量測定、拷貝數(shù)變異、稀有突變檢測、基因相對表達研究、轉(zhuǎn)基因檢測、二代測序結(jié)果驗證等領(lǐng)域。
熒光定量PCR&數(shù)字PCR(ddPCR)區(qū)別:
實驗流程:
確認基因信息,制定實驗方案----DNA/RNA提取,質(zhì)檢----探針設(shè)計合成----上機擴增,讀取結(jié)果----分析實驗結(jié)果----發(fā)送檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)分析
樣本保存運輸要求:
1,血液樣品:抗凝血>0.5 ml,樣品采集后于-20°C 保存
2,動植物組織樣品:新鮮組織(-80°C 保存)或石蠟包埋的組織或95%乙醇中固定的組織,大于100 mg
需要確認的信息如下:
1、具體檢測什么樣本?什么種屬?
2、檢測指標是哪些?
3、是否提供陰性對照?
4、探針和引物客戶是否提供?
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