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PCR

PCR

PCR實驗介紹

實驗步驟

1、 樣本總RNA提取(Trizol法)

1. 取適量待測樣本加入液氮后研磨粉碎;

2. 用1ml Trizol將研磨樣本轉移到取到1.5ml EP管中;

3. 向1.5ml EP管中加入500ul酚氯,仿振蕩混勻后,靜止5分鐘;

4. 4℃ 12000rpm離心10分鐘,小心吸取上清于一新的1.5ml EP管中;

5. 向分離出的上清中加入700ul異丙醇,充分混勻;

6. 4℃ 12000rpm離心10分鐘,小心棄上清;

7. 用75%乙醇洗滌沉淀一次,室溫晾干;

8. 50ul DEPC水溶解RNA沉淀;

9. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2、總RNA質量檢測

使用核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度,測量前先用溶解RNA用的DEPC水調零,操作方法如下:

1.  抬起樣品臂,把樣品加到檢測基座上;

2.  放下樣本臂,使用電腦上的軟件開始吸光值檢測。在上下兩個光纖之間會自動拉出一個樣品柱,然后進行檢測;

3. 當檢測完成后,抬起樣品臂,并用干凈的無塵紙把上下基座上的樣品擦拭干凈。

濃度測定

260nm處讀值為1表示40 ng RNA/μl。樣品RNA濃度計算公式為:A260 X 40 ng/μl

純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法,比值范圍1.8到2.1。即使比值超出這個范圍,RNA樣品也一樣可以用于一些普通實驗中如Northern雜交,RT-PCR和RNA酶保護實驗。

3、逆轉錄合成cDNA

逆轉錄使用invitrogen的逆轉錄試劑盒superscript III

1. 反應體系1建立:

RNA200ng(10uL)
Oligo-dT1uL

2. 混勻,離心。65℃,5分鐘,結束后置于冰上。

3. 反應體系2建立:

反應體系112uL
dNTP(10uM)1uL
0.1M DTT2uL
5X Buffer4uL
RT酶1uL

4. 混勻,離心。置于42℃,水浴60分鐘。

5. 取出后置于85℃,反應10分鐘,滅活逆轉錄酶。

6. 反應結束后將產物置于-20℃待用。

4、實時熒光定量檢測

1. Real time PCR反應體系建立:

cDNA2uL
PCR mix10uL
primer F1uL
primer R1uL
ddH2O6uL

2. 體系混勻后,瞬離一下,置于熒光定量PCR儀上,按照以下條件反應:

3. Realtime PCR反應條件


步驟溫度時間循環數
預變性95℃5 min1
變性95℃10 sec40
退火58℃20 sec
延伸72℃20 sec
熔解曲線95℃15 sec1
60℃60 sec
95℃15 sec


結果示例:

合作流程:









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