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明膠酶譜實驗簡介：

明膠酶譜實驗是一種用于檢測基質金屬蛋白酶（MMPs）活性的實驗技術，特別是MMP-2和MMP-9這兩種在細胞遷移、侵襲和組織修復中起關鍵作用的酶。明膠酶譜實驗可以檢測MMP2和MMP9的活性，是分子生物學的常用實驗技術之一。該實驗通過SDS-聚丙烯酰胺（含0.1%明膠）電泳分離樣品，然后在二價金屬離子存在的緩沖系統中恢復MMP-2和MMP-9的活性，使凝膠中的明膠在相應的遷移位置處水解，最后用考馬斯亮藍染色并脫色，從而在藍色背景上顯示出白色條帶，條帶的強度與MMP-2和MMP-9活性成正比。

實驗步驟：

1. 樣品準備：取對數期癌細胞，并在無血清培養基中培養24小時，收集上清液并保存在-70°C下備用。

2. 蛋白質濃度調整：根據細胞數調整蛋白質濃度，并與上樣緩沖液混合。

3. 電泳：在4℃下進行SDS-PAGE電泳約1.5小時。

4. 洗脫：電泳結束后，將凝膠放入洗脫液中振蕩洗脫，然后用漂洗液漂洗。

5. 孵育：將凝膠置于孵育液中37℃孵育42小時。

6. 染色與脫色：孵育后，用染色液染色3小時，然后用脫色液進行脫色，直至條帶清晰可見。

7. 圖像分析：使用凝膠圖像分析系統分析并讀取譜帶面積、寬度和灰度值，進行統計分析。

注意事項：

1. 避免氣泡：在制備聚丙烯酰胺時應注意避免氣泡。

2. 緩沖液配制：明膠酶譜的活性受鈣離子、鋅離子和pH值等因素影響，因此緩沖液的制備應嚴格準確，應使用超純水，并控制孵育溫度。

3. pH值控制：孵育溶液的pH值應在7.5至7.6之間，以保持酶的最佳活性。

4. 避免變性：在樣本處理過程中避免樣品中的酶發生變性和失活，不宜對蛋白樣品進行沸騰處理，且上樣緩沖液中應避免含有β-巰基乙醇或DTT。

5. 明膠保存：明膠應儲存在4°C下，制備后1周內使用