一、TUNEL檢測:
TUNEL染色是檢測細胞凋亡染色的常見方法,其原理是細胞在發生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA?;蚪MDNA斷裂時,暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素、生物素標記的dUTP,從而可以通過熒光顯微鏡或化學顯色方法檢測細胞凋亡的情況。
根據樣本選擇相應樣本處理,動物組織需包埋選擇1,動物組織需冰凍選擇2,細胞爬片樣本選擇3,細胞涂片樣本選擇4。
1、 石蠟包埋組織切片
① 將組織切片放入二甲苯中浸泡5min,重復1次,以徹底脫掉石蠟。
② 100%乙醇浸泡5min,重復1次。
③ 梯度乙醇(90、80、70%)各浸洗1次,每次3min。
④ PBS輕輕潤洗,濾紙小心吸干多余液體。用石蠟筆或疏水筆在周圍描繪樣品分布輪廓,便于下游透性處理和平衡標記操作。
⑤ 配制Proteinase K工作液:PBS稀釋2mg/mL的Proteinase K溶液(1:100),終濃度為20μg/mL。
⑥ 滴100μL上述Proteinase K工作液,使其全部覆蓋,孵育20min。
⑦ PBS潤洗樣本,并用濾紙小心吸樣本周圍液體。處理后放于濕盒保存。
2、組織冰凍切片
① 玻片浸沒于4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)中固定,孵育15min。
② 用濾紙小心吸干周圍多余液體。
③ 將玻片浸沒于PBS溶液,孵育15min。
④ 用濾紙小心吸干周圍多余液體。用石蠟筆或疏水筆在周圍描繪樣品分布輪廓,便于下游透性處理和平衡標記操作。
⑤ 配制Proteinase K工作液:PBS稀釋2mg/mL的Proteinase K溶液(1:100),終濃度為20μg/mL。
⑥ 滴加100μL上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,室溫孵育10min。
⑦ 用PBS溶液潤洗樣本3次。
⑧ PBS潤洗樣本,并用濾紙小心吸樣本周圍液體。處理后放于濕盒保存。
3、細胞爬片的準備
在Lab-Tek載玻片小室(Chamber Slides)上培養貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后,用PBS洗2遍載玻片。
4、 細胞涂片的制備
① 準備多聚賴氨酸包被的載玻片:100 μL 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液滴至載玻片表面,涂散為一薄層,晾干。去離子水漂洗,晾干30-60 min。
② 以約2×107個細胞/mL的濃度將細胞重懸于PBS中,吸取100μL細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上,用一片干凈載玻片輕柔涂開細胞懸液。
③ 固定細胞,將載玻片浸入含4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛染色缸中,4℃放置25min。
④ 洗滌載玻片,將其浸入PBS中,室溫放置5min。重復用PBS洗1次。
⑤ 用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。
⑥ 配制Proteinase K工作液:PBS稀釋2mg/mLProteinase K溶液(1:100),終濃度為20μg/mL。
⑦ 滴加100μL上述Proteinase K溶液,使其被全部覆蓋,室溫孵育5min(或浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液,孵育5min進行通透處理)。
⑧ 在盛有PBS溶液敞口燒杯中浸沒清洗樣本2次。
⑨ 用濾紙小心吸樣本周圍液體。處理后放于濕盒保存。
三、實驗流程
① 按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer。
② 樣本滴加100μL 1×Equilibration Buffer,使其全部覆蓋待檢樣本區域,室溫孵育10-30min?;驅⑤d玻片放入1個含1×Equilibration Buffer的缸中,保證緩沖液沒過樣本。平衡細胞的同時在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix,并依下表,準備足夠量的用于所有實驗和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液。
表 準備用于實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液
組分 | 體積(μL/50μL體系) |
ddH2O | 34 |
5×Equilibration Buffer | 10 |
FITC-12-dUTP Labling Mix | 5 |
Recombinant TdT Enzyme | 1 |
陰性對照體系:準備1份不含TdT酶的對照孵育緩沖液,用ddH2O替代TdT酶。
③ 平衡后的區域周圍用吸水紙洗掉100μL 1×Equilibration Buffer中的大部分,在5cm2面積細胞上加入50μLTdT孵育緩沖液。之后操作用鋁箔紙包裹避光處理。
④ 塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布。濕盒底部放上用水浸濕的紙巾,將載玻片置于濕盒內,37℃孵育60min。
⑤ 移除塑料蓋玻片,將切片置于PBS溶液孵育5min。
⑥ 輕輕去掉多余液體,換用新鮮PBS溶液孵育5 min,重復1次。
⑦ 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。
⑧ 樣本在染色缸染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液(1μg/mL,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,放置5min。
⑨ 洗滌樣本,將載玻片浸入去離子水,放置5min,重復2次,總共洗3次。
⑩ 叩干載玻片上多余水且用吸水紙擦拭細胞周邊區域。
? 立即在熒光顯微鏡下分析樣本,用標準的熒光過濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光;在>620nm下觀察PI的紅色熒光,或在460nm觀察藍色的DAPI。如有必要,載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。
1、提供固定完全的組織樣本。組織離體后,選擇合適的固定液和容器立即固定,固定液的量建議大于組織體積的10-15倍,固定時間建議24-48h,大標本固定12h,再切開固定。固定完全后盡快送檢。標本常溫(24℃左右)或冷藏(4℃)固定,切勿冷凍結冰,固定樣本常溫運輸送樣。
2、提供編號清晰的蠟塊或蠟頭。
3、石蠟切片常溫運輸,冰凍切片-80℃保存干冰運輸。
4、爬片必須充分固定,常溫運輸。
1、任何實驗方法都存在局限性,根據TUNEL實驗的本質問題,公司不能保證結果中凋亡細胞的多少(即假陽性、或偏陰性結果)。
2、TUNEL染色建議先做預實驗(預實驗由客戶提供預期高表達的樣本,蠟塊或切片皆可),確認效果后,再做正式實驗。預實驗結果優先由客戶自行確認,預實驗和正式實驗間隔周期不要太久,建議連續三周內完成。
3、正式實驗的趨勢我司不做保證。
六、實驗圖:
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